Barbara Hanna Zimmermann

Toxoplasma gondii es un parasito del filum Apicomplexa, su ciclo de vida es principalmente intracelular e infecta amplia variedad de hospederos, y tiene particular éxito infectando los homeotermos. Adicionalmente, tiene distribución mundial y se estima que aproximadamente un tercio de la población humana tiene una infección de tipo crónico. Ahora bien, los tratamientos existentes contra la toxoplasmosis con sulfadiazina y pirimetamina son efectivos contra infecciones agudas, pero tienen efectos secundarios adversos en la salud de los pacientes. Por otro lado, este tratamiento ha demostrado una efectividad limitada contra el estadio de quiste en infecciones crónicas. De acuerdo a lo anterior, alternativas terapéuticas son necesarias, razón por la cual es oportuno comprender mejor el metabolismo del parásito. Dentro de las rutas esenciales de T. gondii encontramos el metabolismo de pirimidinas. Las pirimidinas son componentes estructurales de diferentes biomoléculas fundamentales como los nucleótidos y ácidos nucleicos. La participación de las pirimidinas en procesos metabólicos como la síntesis de ADN y ARN hace que sean de especial interés en un patógeno como T. gondii. De hecho, algunos de los medicamentos utilizados para tratar infecciones de T. gondii y Plasmodium tienen como blanco pasos específicos en el metabolismo de pirimidinas. Las enzimas involucradas en la síntesis de novo de pirimidinas son determinantes en la replicación del parasito, por ejemplo, la enzima que cataliza el cuarto paso de la vía, la dihiidrorotato deshidrogenasa (DHODH). Esta enzima cataliza la oxidación del (s)-dihiroorotato a orotato. A su vez, cataliza la única reacción de tipo redox de la vía de novo y esta acoplada a la cadena respiratoria a través de transferencia de electrones. Estudios previos determinaron que la deleción del gen de DHODH en T.gondii (TgDHODH), con el propósito generar parásitos con auxotrofía por uracilo fue  únicamente posible cuando se utilizaba una versión catalíticamente deficiente de TgDHODH. Estos resultados sugieren que TgDHODH es esencial por dos razones; la generación de reservas esenciales de pirimidinas y una segunda  función mitocondrial  independiente de la actividad de la enzima hasta ahora desconocida. El objetivo del presente estudio es analizar si hay una interacción estructural entre  TgDHODH y los complejos de la membrana mitocondrial que pudiera explicar la posible función adicional de TgDHODH dentro de la replicación del parasito. En primer lugar, se realizará un aislamiento de la mitocondria a partir de taquizoitos de T. gondii, con el objetivo de realizar una electroforesis nativa para separar los complejos mitocondriales y poder determinar el tamaño del complejo que pudiera tener interacción con TgDHODH. Posteriormente, se correrá una segunda dimensión denaturante para identificar el tamaño de las proteínas presentes en el complejo posiblemente asociado a TgDHODH, la visualización de estas proteínas será a través de tinción de plata. En paralelo, a partir de parásitos transformados se producirá myc-tagged TgDHODH, con el propósito de aislar las proteínas en interacción física con TgDHODH a través de una resina anti-myc. Finalmente, la identificación de las proteínas aisladas se llevará a cabo utilizando secuenciación de aminoácidos. Estos resultados permitirán comprender el comportamiento de TgDHODH y de esta manera aportar información para el diseño de posibles tratamientos que puedan inhibir su función independiente de catálisis y de esta forma impedir la replicación del parásito

Toxoplasma gondii es un parasito del filum Apicomplexa, su ciclo de vida es principalmente intracelular e infecta amplia variedad de hospederos, y tiene particular éxito infectando los homeotermos. Adicionalmente, tiene distribución mundial y se estima que aproximadamente un tercio de la población humana tiene una infección de tipo crónico. Ahora bien, los tratamientos existentes contra la toxoplasmosis con sulfadiazina y pirimetamina son efectivos contra infecciones agudas, pero tienen efectos secundarios adversos en la salud de los pacientes. Por otro lado, este tratamiento ha demostrado una efectividad limitada contra el estadio de quiste en infecciones crónicas. De acuerdo a lo anterior, alternativas terapéuticas son necesarias, razón por la cual es oportuno comprender mejor el metabolismo del parásito. Dentro de las rutas esenciales de T. gondii encontramos el metabolismo de pirimidinas. Las pirimidinas son componentes estructurales de diferentes biomoléculas fundamentales como los nucleótidos y ácidos nucleicos. La participación de las pirimidinas en procesos metabólicos como la síntesis de ADN y ARN hace que sean de especial interés en un patógeno como T. gondii. De hecho, algunos de los medicamentos utilizados para tratar infecciones de T. gondii y Plasmodium tienen como blanco pasos específicos en el metabolismo de pirimidinas. Las enzimas involucradas en la síntesis de novo de pirimidinas son determinantes en la replicación del parasito, por ejemplo, la enzima que cataliza el cuarto paso de la vía, la dihiidrorotato deshidrogenasa (DHODH). Esta enzima cataliza la oxidación del (s)-dihiroorotato a orotato. A su vez, cataliza la única reacción de tipo redox de la vía de novo y esta acoplada a la cadena respiratoria a través de transferencia de electrones. Estudios previos determinaron que la deleción del gen de DHODH en T.gondii (TgDHODH), con el propósito generar parásitos con auxotrofía por uracilo fue  únicamente posible cuando se utilizaba una versión catalíticamente deficiente de TgDHODH. Estos resultados sugieren que TgDHODH es esencial por dos razones; la generación de reservas esenciales de pirimidinas y una segunda  función mitocondrial  independiente de la actividad de la enzima hasta ahora desconocida. El objetivo del presente estudio es analizar si hay una interacción estructural entre  TgDHODH y los complejos de la membrana mitocondrial que pudiera explicar la posible función adicional de TgDHODH dentro de la replicación del parasito. En primer lugar, se realizará un aislamiento de la mitocondria a partir de taquizoitos de T. gondii, con el objetivo de realizar una electroforesis nativa para separar los complejos mitocondriales y poder determinar el tamaño del complejo que pudiera tener interacción con TgDHODH. Posteriormente, se correrá una segunda dimensión denaturante para identificar el tamaño de las proteínas presentes en el complejo posiblemente asociado a TgDHODH, la visualización de estas proteínas será a través de tinción de plata. En paralelo, a partir de parásitos transformados se producirá myc-tagged TgDHODH, con el propósito de aislar las proteínas en interacción física con TgDHODH a través de una resina anti-myc. Finalmente, la identificación de las proteínas aisladas se llevará a cabo utilizando secuenciación de aminoácidos. Estos resultados permitirán comprender el comportamiento de TgDHODH y de esta manera aportar información para el diseño de posibles tratamientos que puedan inhibir su función independiente de catálisis y de esta forma impedir la replicación del parásito